克米特·科爾-2012 年 1 月 24 日

內源性逆轉錄病毒是古代感染的殘餘，已成為人類基因組的一部分，與精神分裂症的發展有關。但德國的研究人員發現，內源性逆轉錄病毒基因表達升高可能是由抗精神病藥治療引起的，而不是精神分裂症本身。
Endogenous retroviruses, remnants of ancient infections that have become part of the human genome, have been associated with the development of schizophrenia. But researchers in Germany find that elevated endogenous retroviral gene expression may result from treatment with antipsychotics, rather than from schizophrenia itself.
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克米特·科爾Kermit Cole，MFT，Mad in America 的創始編輯，在新墨西哥州聖達菲市擔任夫妻和家庭治療師。受 Open Dialogue 的啟發，他作為團隊的一員工作，並為有成員被確定為患者的夫婦和家庭提供諮詢。他在住院治療方面的工作——主要是與嚴重創傷和/或“精神病”的客戶——導致對系統哲學和實踐的力量和美的欣賞，作為對個體病理學的普遍關注的替代方案。作為一名前電影製片人，他擁有哈佛大學的心理學本科和碩士學位，以及費城關係委員會的 MFT 學位。他是陶斯研究所和布魯塞爾自由大學的博士生。您可以通過kcole@madinamerica.com 與他聯繫。

抗精神病藥物對人腦細胞內源性逆轉錄病毒 (HERV) 轉錄的影響
人類內源性逆轉錄病毒 (HERV) 與各種神經和神經精神疾病有關。在精神分裂症患者的腦樣本或腦脊液中反複檢測到至少三個 HERV 組 HERV-W、ERV9 和 HERV-K(HML-2) 的轉錄本和蛋白質，這表明 HERV 活性的改變可能在發病機制中發揮作用. 目前的療法還包括可能誘導表觀遺傳改變並因此影響 HERV 表達的抗精神病藥和/或抗抑鬱藥。為了研究這些藥物對 HERV 轉錄活性的影響，使用逆轉錄病毒特異性微陣列和 qRT-PCR 分析了用丙戊酸 (VPA)、氟哌啶醇、利培酮和氯氮平處理的各種人腦細胞系的 HERV 表達譜. 對 52 個 HERV 亞組的調查顯示，VPA 以劑量依賴性方式上調了幾種 I 類和 II 類 HERV 元件。在人膠質母細胞瘤細胞系 SK-N-SH 和 SK-N-MC 中分別觀察到對 HERV-W 和 ERV9 組的最強影響。HERV-K(HML-2) 元素的轉錄水平不受影響。HERV-W、ERV9 和 HERV-K(HML-2) 分類群的轉錄在精神分裂症患者、雙相情感障礙患者和健康對照組的藥物死後腦樣本中得到進一步量化。精神分裂症患者表現出與 VPA 治療相關的顯著更高的 HERV-W 轉錄。然而，在 ERV9 的情況下，增加的轉錄水平不能僅僅通過 VPA 治療來解釋，因為與健康對照相比，未治療的患者也發現了輕微的增加。HERV-K(HML-2) 元素似乎在一些獨立於藥物治療的雙相情感障礙患者中上調。總之，這些結果表明，抗精神病藥物可能有助於增加神經精神疾病患者不同 HERV 分類群的表達。

介紹

精神分裂症是一種高度複雜和嚴重的神經精神疾病，病因不明。根據來自家庭、雙胞胎和收養研究以及流行病學調查的數據集，精神分裂症的發病機制涉及多基因影響和環境風險因素的相互作用，這些因素對懷孕期間大腦的成熟[1]、[2]、[3 ]，[4]。對環境因素的易感性可能受遺傳控制，反之亦然，環境因素會影響基因組印記，導致基因表達改變。此外，這種表觀遺傳改變可能會垂直轉移到後代[5]. 冬春分娩、圍產期感染、家庭擁擠、城市地區的教養和養寵物等環境因素支持了精神分裂症可能由影響遺傳易感個體大腦的感染因子引發的概念[1]、[6]、[ 7]、[8]、[9]。

逆轉錄病毒是未知病因的 CNS 疾病的候選感染因子，因為它們具有神經嗜性和潛伏性（綜述於[10]、[11]）。特別是人類內源性逆轉錄病毒 (HERV) 與精神分裂症和其他神經系統疾病反復相關（在[6]中進行了綜述）。HERV 是人類基因組的天然成分，至少佔人類 DNA 的 8%。它們被認為是由外源性逆轉錄病毒引起的古代生殖系感染的殘餘物，這些逆轉錄病毒已被基因固定並以孟德爾方式傳播[12]，[13]. 在進化過程中，這些元素通過反轉錄和/或再感染的重複事件被放大並傳播到整個基因組中。迄今為止，它們包含大約 500,000 個元素[14]。已經進化出有效的細胞機制來限制它們的細胞內活動，包括表觀遺傳機制，例如 DNA 甲基化和染色質重塑，以及轉錄後加工和 RNA 干擾[15]、[16]、[17]。然而，發現大多數 HERV 組的至少一些成員仍以組織特異性方式具有轉錄活性[18]、[19]。

在腦樣本中，反複檢測到精神分裂症和分裂情感障礙患者的腦脊液和血液中至少三個 HERV 組 HERV-W、ERV9 和 HERV-K（HML-2）的轉錄物和/或蛋白質水平升高。 20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。這表明細胞控制機制的失敗導致精神分裂症中不同 HERV 元件的激活或上調。

然而，大多數精神分裂症患者已獲得抗精神病藥物多年[20]、[22]、[24]、[26]。甚至首次發作的患者或新發精神分裂症患者在研究攝入前至少服用藥物一周或多周[22]、[23]、[25]。因此，無論觀察到的 HERV 活性變化是疾病的病因還是結果，評估實驗數據的一個嚴重不可估量的問題是使用已知會通過誘導表觀遺傳修飾影響基因表達的抗精神病藥和/或抗抑鬱藥治療患者。 27]，[28]. 因此，問題出現了，精神分裂症患者腦組織中某些 HERV 轉錄物的過度表達是否可能是由於藥物的作用而不是疾病造成的。

為了解決藥物對 HERV 活性的潛在影響，我們分析了用不同濃度的丙戊酸 (VPA)、氟哌啶醇、利培酮和氯氮平通過逆轉錄病毒特異性微陣列 (RetroArray) 和定量逆轉錄酶 PCR (qRT-PCR)。然後將來自細胞培養實驗的數據與 56 個死後腦樣本中關於各自患者藥物的 HERV 活性進行比較。

結果

為了研究抗精神病藥物對 HERV 表達的影響，選擇不同的人腦細胞系用於細胞培養模型，包括膠質母細胞瘤細胞（U-138MG 和 U-251MG）、神經母細胞瘤細胞（SK-N-SH 和 SK-N-MC） ，以及人類神經乾細胞系 HNSC.100。所有細胞係都顯示出幾乎相同的 HERV 核心轉錄譜，由 I 類和 II 類 HERV 的 12 個 HERV 亞組組成，這些亞組先前已為人腦組織建立[20]（表 S1）。所有細胞係都用不同劑量的 VPA 處理。U-138MG、SK-N-SH 和 HNSC.100 細胞另外用氟哌啶醇、利培酮或氯氮平處理。這些藥物的使用濃度符合臨床相關劑量[28]並且通過 MTT 分析確定是非細胞毒性的。所有進一步的實驗均使用來自至少兩個獨立處理的 RNA 樣本進行。使用逆轉錄病毒特異性微陣列監測 HERV 轉錄模式的變化，該微陣列允許同時檢測 I 類（γ逆轉錄病毒相關）、II 類（β逆轉錄病毒相關）和 III 類（spumaretrovirus 相關）HERV 的 52 個代表性 HERV 亞組[19 ]，[29]。圖 1顯示了用 1 和 5 mM VPA 處理的細胞的代表性微陣列實驗。除了[20]中定義的大腦核心 HERV 配置文件之外，由具有普遍活性的 HERV 分類群（HERV-E、HERV-F、ERV9 和 HERV-K）組成，一些很少轉錄的 HERV 元件（HERV-T、HERV-FRD、HML-1、HML-2、HML- 5 組和 HERV-L 組）被檢測到。在幾個 I 類組（HERV-E、HERV-H、HERV-W、ERV9、HERV-F）和 II 類 HERV 組（HML-3、 HML-4、HML-6、HML-9、HML-10）（圖 1）。

表 1總結了用最高濃度的 VPA、氟哌啶醇、利培酮或氯氮平處理細胞後 HERV 類群的轉錄活性。與 VPA 相比，氟哌啶醇或利培酮治療僅導致輕微激活 HERV-E、RGH2（HERV-H 組）、HERV-Fb（HERV-F 組）、HERV-W、ERV9（ERV9 組）、HML -9 和 HERV-KC4（HML-10 組）。在氟哌啶醇的情況下，特別是在 SK-N-SH 細胞中觀察到 HERV-Fb 的劑量依賴性上調。氯氮平顯示 ERV9 和 HERV-KC4（HML-10 組）活性略有增加。值得注意的是，根據 HERV 芯片數據，HML-2 組的成員似乎不受所有細胞系中任何藥物的影響。

為了確認和量化微陣列結果，對 HERV 分類群 HERV-W、ERV9（ERV9 組）、HERV-F、HML-2、Seq26（HML-3 組）和 HERV-KC4（HML-10 組）進行了 qRT-PCR （在圖 1中以紅色框表示，在表 1中用星號表示）。源自pol基因的特定引物對用於 HERV-W 和 HERV-F 組，ERV9、Seq26 和 HERV-KC4 [19]的亞組特異性pol引物；M. Vincendeau，未發表的數據）。對於 HERV-K(HML-2)，使用源自gag基因的組特異性引物，能夠嚴格區分其他 HERV-K 組。

在兩個獨立實驗中，使用來自用 1 mM 和 5 mM VPA 處理的 U-138MG、U-251MG、SK-N-SH、SK-N-MC 和 HNSC.100 細胞的 RNA 進行 QRT-PCR。圖2A 總結了 5 mM VPA 濃度下六種 HERV 分類群的相對轉錄的平均增加。詳細數據如圖 S1和表 S2所示. 在所有膠質母細胞瘤和神經母細胞瘤細胞系中，觀察到至少一個 HERV 亞組的 VPA 依賴性上調。在 U-251MG 細胞中，與未處理的細胞相比，發現 HERV-W、ERV9、HERV-F 以及 Seq26 上調高達 6 倍。在神經母細胞瘤細胞中觀察到 HERV 活性的顯著變化。在用 VPA 處理後，SK-N-SH 細胞中的 HERV-W 轉錄平均增加了 22 倍，而 SK-N-MC 細胞中的 ERV9 轉錄增加了 18 倍。在神經乾細胞系 HNSC.100 中未觀察到顯著的上調，但細胞週期控制基因 p21 的 VPA 依賴性活性非常高（數據未顯示）。發現VPA對HERV-K(HML-2)組的轉錄活性沒有顯著影響。

與 VPA 相比，典型的抗精神病藥氟哌啶醇以及非典型抗精神病藥利培酮和氯氮平對 HERV 轉錄幾乎沒有影響（圖2B ）。只有 HERV-F 在用氟哌啶醇處理後的 SK-N-SH 和加入利培酮後的 HNSC.100 細胞中出現輕微上調；用氯氮平處理後 U-138MG 細胞中的 HERV-W。

HERV 組 HERV-W、ERV9 和 HERV-K(HML-2) 反復與精神分裂症相關。由於 VPA 在細胞培養模型中對 HERV-W 和 ERV9 轉錄有顯著影響，但對 HERV-K(HML-2) 沒有影響，我們進一步研究了 ERV9、HERV-W 和 HERV-K(HML-2) 的轉錄在精神分裂症和雙相情感障礙患者的死後腦樣本中，他們的抗精神病藥物（圖 3）。對之前用於微陣列實驗[20]的 Stanley Array Collection [8]的 RNA 樣本進行了 QRT-PCR 。對 18 名精神分裂症患者樣本、20 名雙相情感障礙患者樣本和 18 名健康對照者進行了檢查。

在接受 VPA 治療的兩個患者組中都觀察到了 ERV9 和 HERV-K(HML-2) 轉錄的輕微但不顯著的增加。在獲得 VPA 的精神分裂症患者中檢測到 HERV-W 轉錄的顯著上調。與健康對照組相比，精神分裂症和雙相情感障礙患者的 ERV9 轉錄水平與藥物無關。同樣，在接受和不接受 VPA 治療的雙相情感障礙患者中，HERV-K(HML-2) 元素的轉錄水平升高。在兩個患者組中，HERV-W 的轉錄沒有顯著升高。

為了排除酒精或藥物濫用可能影響數據，我們進一步根據藥物或酒精濫用對患者進行分組。未觀察到酒精或藥物消耗對 HERV-W、ERV9 和 HERV-K(HML-2) 轉錄的顯著影響（圖 S2）。

討論

HERV，特別是 HERV-W、ERV9 和 HERV-K(HML-2) 與精神分裂症和其他神經系統疾病有關[20]、[21]、[22]、[24]、[25]；在[6]中進行了審查。在患者的腦樣本、血漿或腦脊液中檢測到的 HERV 轉錄物和/或蛋白質水平升高可能是病因或疾病的結果。此外，它們可能是影響表觀遺傳環境的藥物引起的表觀遺傳變化的指標。

使用逆轉錄病毒特異性微陣列以及 qRT-PCR，我們研究了抗精神病藥物對五種腦源性細胞系（包括神經乾細胞、膠質母細胞瘤和神經母細胞瘤細胞）中 HERV 轉錄的影響。氟哌啶醇、利培酮和氯氮平未觀察到或僅觀察到輕微影響。相比之下，VPA 增加了許多 HERV 的轉錄，包括 ERV9 和 HERV-W 組的成員。VPA 是一種組蛋白去乙酰化酶抑製劑，因此可能導致 HERV 啟動子周圍的染色質重塑，從而導致表達增強。先前的研究表明，VPA 可誘導染色質修飾，並與其他抗精神病藥物聯合使用可改變精神分裂症和雙相情感障礙患者的 DNA 甲基化模式[30]、[31]、[32]。有趣的是，在我們的研究中，VPA 的作用似乎是細胞類型依賴性的，並且主要在兩種神經母細胞瘤細胞系中觀察到。SK-N-SH 和 SK-N-MC 在幾個特徵上有所不同，例如多巴胺-β-羥化酶的表達水平[33]，表明存在差異的表觀遺傳背景。這可以解釋兩個不同的 HERV 組 HERV-W 和 ERV9 的轉錄分別在 SK-N-SH 和 SK-N-MC 中被 VPA 高度增加。

HERV-K(HML-2) 組的轉錄不受所研究的所有細胞系中的任何藥物的顯著影響。在之前的一項研究中，使用逆轉錄病毒特異性微陣列對精神分裂症和雙相情感障礙患者腦樣本中廣泛的 HERV 表達譜分析顯示，與健康相比，兩個患者組中 HERV-K(HML-2) 轉錄物的顯著過度表達控制[20]. 為了驗證這些數據，並重新評估抗精神病藥物的可能影響，我們使用相同的患者材料進行 qRT-PCR。根據患者用藥對數據進行分類，我們觀察到與未治療的患者相比，接受 VPA 治療的精神分裂症患者腦組織中 ERV9 和 HERV-W 轉錄活性增加的偏差。除了 VPA 的影響外，與健康對照組相比，在兩個患者組中都觀察到了 ERV9 轉錄物的輕微升高。與藥物無關，在一些雙相情感障礙患者中發現了 HERV-K(HML-2) 轉錄的顯著上調。這些數據表明，至少在某些情況下，某些逆轉錄病毒元件的轉錄激活可能與疾病有關。然而，[27]這種不可估量性也可以解釋最近發表的研究[20]、[21]、[22]、[24]、[25]的不同發現。因此，本研究分析了對藥物濫用和酒精影響最大的參數[26]，但未顯示出相關差異。

總之，我們的數據表明人類腦細胞中 HERV 活性的複雜調節。患者中 HERV 的差異表達可能取決於環境因素，包括表觀遺傳藥物以及病理狀況。此外，表觀遺傳模式的個體差異可能發揮作用。大多數 HERV 構成多拷貝家族，例如 HERV-K(HML-2) 每個單倍體人類基因組包含大約 60 個不同的基因座，其中 16 個在人腦中差異轉錄[34]. HERV-W 和 ERV9 組分別代表大約 40 和 300 個前病毒拷貝。一個 HERV 組的每個前病毒可能在不同的表觀遺傳環境下差異表達。這可以解釋在不同實驗設置中獲得的不一致結果。一個有趣的假設是，許多有缺陷的 HERV 拷貝的轉錄激活可能會干擾少數蛋白質編碼 HERV [26]。例如，這可能是由相鄰細胞啟動子[34]或雙向 HERV 啟動子[35]表達的反義 HERV 轉錄物引起的。這種自我調節機制可能構成一個複雜的 HERV 轉錄控製網絡，幫助 HERV 在進化過程中逃避純化選擇。

材料和方法

人腦 RNA 樣本

來自 12 名精神分裂症患者、20 名雙相情感障礙患者和 18 名健康對照（斯坦利陣列收藏）的前額葉皮層（布羅德曼區 46）的總 RNA 樣本由馬里蘭州貝塞斯達的斯坦利醫學研究所友情提供。斯坦利醫學研究所保證，在所有情況下，近親都以書面形式允許為研究目的檢查大腦。可以從研究所的網站www.stanleyresearch.org獲得有關 Stanley Brain 收藏的詳細聲明。

細胞系和藥物治療

人膠質母細胞瘤細胞系 U-138MG (HTB-16) 和 U-251MG (HTB-17)，人神經母細胞瘤細胞系 SK-N-SH (HTB-11) 和 SK-N-MC (HTB-10)，和人類神經乾細胞系 HNSC.100 [36]從 ATCC 購買或由德國微生物和細胞培養物保藏中心 (DSMZ, Braunschweig, Germany) 認證並按推薦培養。細胞培養基中添加了濃度為 100 µg/ml 的 10% 胎牛血清和青黴素-鏈黴素。使用 LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit, Sigma 對所有細胞進行常規支原體污染檢測。用 1 和 5 mM 丙戊酸 (VPA) 或 0.1、1 和 10 µM 氟哌啶醇、利培酮或氯氮平 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) 處理細胞 24 小時。U-251MG 細胞另外用 1 和 5 mM VPA 處理 72 小時。如所述[37]，通過在 96 孔板中的比色 MTT 測定法確定濃度是非細胞毒性的. 作為對照，與每個實驗平行培養相同傳代的未處理細胞。

RNA製備、DNA酶處理和cDNA合成

根據製造商的說明 (Qiagen, Hilden, Germany)，使用 RNeasy Kit 從培養的細胞中分離總 RNA。為了排除 DNA 污染，使用 RQ1 DNase 試劑盒（Promega，Mannheim，Germany）用 100 單位/μg 無 RNase 的 DNase 處理 RNA 樣品，並使用混合寡核苷酸引物通過 PCR 進行測試[19]。根據製造商的說明（Invitrogen，Karlsruhe，Germany），隨後使用 SuperScript II First-Strand Synthesis 僅轉錄 DNA 陰性 RNA 樣品（1-2 µg）。

逆轉錄病毒特異性微陣列 (RetroArray)

如前所述[18]、[19]、[20]進行雜交探針合成和MOP-PCR標記，以及逆轉錄病毒特異性微陣列的DNA芯片製備、雜交和後處理。使用 Affymetrix Scanner GMS 418（激光功率 100%，增益 50-60%）掃描雜交微陣列，並使用假彩色映射進行圖像可視化。

通過 qRT-PCR 定量 HERV 轉錄物

對於pol (RT) 序列的擴增，使用了 HERV-W 組的特異性引物（正向引物：TGAGTCAATTCTCATACCTG，反向引物：AGTTAAGAGTTCTTGGGTGG）和 HERV-F（正向引物：CCTCCAGTCACAACAACTC，反向引物：TATTGAAGAAGGCGGCTGG）。亞組特異性引物用於 ERV9（ERV9 組）（正向引物：CCTCAACTGTTTTAATGTCTTAGGGCGAGG，反向引物：CCCTCATCTGTTTGGTCAGGCCC），Seq26（HML-3 組）（正向引物：CTGCAGCCTGCTAAGCG，反向引物：CACTGTGAAAATTTTTTACGAG）和 HERV-KC4（HML 組-10)（正向引物：GAATCTCTTCTAATTTGAACCTTTTGAGG, 反向引物：CCCACAGTTGTCAAACTTTTGTAGGC ) [19]；M. Vincendeau，未發表的數據）。對於 HERV-K(HML-2) 組，使用gag特異性引物進行定量（正向引物：GGCCATCAGAGTCTAAACCACG，反向引物：CTGACTTTCTGGGGGTGGCCG）。作為 VPA 治療的對照，p21 如所述[38]進行量化。

QRT-PCR 使用 Roche LightCycler 480 系統，使用 LC480 DNA Master SYBR Green 和標準 LightCycler 方案（Roche Diagnostics，Mannheim）進行。在 95°C 進行 10 分鐘的初始變性步驟後，進行 50 個擴增循環，即 95°C 10 秒、60°C 5 秒和 72°C 10 秒。通過將溫度降低至 65°C 保持 15 秒，然後將溫度升高至 95°C，為最終的 PCR 產物生成熔解曲線。以 0.2°C 的增量測量熒光。RNA-聚合酶 II (RPII) 轉錄物作為內標進行分析[39]。ΔC _T值計算如下：C _T (RPII)- C _T（HERV 元件），並歸一化為 RPII 水平。^{通過 2 -ΔΔCT}方法[40]計算處理細胞中 HERV 轉錄的 x 倍誘導，其值歸一化為 RPII 並相對於未處理細胞中的轉錄。死後樣本的相對 HERV 轉錄比率是根據 qRT-PCR 效率和靶基因與管家基因 RPII 的交叉點偏差計算的[41]。每個基因的定量 RT-PCR 實驗至少一式三份進行。